112高考衛生技術

生物技術學

申論題

擬答
《題型解析》：幹細胞研究是再生醫學重要一環，此題純粹是送分，屬於簡單易寫的問題。此題容易拿下15-20分，甚至滿分25分。
誠如上課一再提醒，解釋名詞一定要詳細了解。抗體抗原特異性是細胞分離與免疫分析的關鍵，特異性抗體的親和性管柱與流式細胞分類儀(flow cytometry mrthod)加以分離純化，即可得分。最後是衛福部的細胞治療特管法。
  1. 幹細胞的定義與特性
    幹細胞(stem cells)是生物體最原始未分化的細胞，它具有再生與分化的能力，可以增殖成為原來相同的細胞也可以分化成為其他細胞如肝細胞，肌肉細胞，血球細胞等，以及其他具有特定功能的細胞。簡言之，幹細胞係指一群尚未分化、但具有自我更新的能力、以及增殖分化成各類成熟組織能力的原始細胞。
    幹細胞因具有以上這些特性，所以可用來修補受損的組織或器官，甚至還可以建構出完整的器官。幹細胞被稱為“源母全功能細胞”，因為它們具有形成特定的組織分化及或器官發育的能力。
  2. 胚胎幹細胞、成體幹細胞與誘導式多功能性幹細胞
    1. 胚胎幹細胞特性：
      胚胎幹細胞（embryonic stem cell）存在於胚胎發育早期，受精卵分裂五天後囊胚中，可發育為不同的細胞，是所有細胞最初期的形態，能分化出成體的所有組織和器官，包括生殖細胞等。
      1. 成體幹細胞特性：
        成體幹細胞（adult stem cell）也稱成人幹細胞，存在於已成熟的個體的成體組織中，典型的代表包括骨髓幹細胞、脂肪幹細胞、造血幹細胞與間質幹細胞等，這些幹細胞並不是全能幹細胞，被稱之為多功能幹細胞。成體幹細胞的最佳例子是造血幹細胞。骨髓移植，幹細胞移植，或血液移植，被移植的細胞是造血幹細胞。這種細胞是主要存在於成人骨髓中。
      2. 誘導式多功能性幹細胞特性：
        誘導性多能幹細胞（Induced pluripotent stem cell），又稱人工誘導多功能幹細胞，簡稱爲iPS細胞（iPSC），是一種由哺乳動物成體細胞經轉入特異分化轉錄因子等手段，可逆性分化形成的多功能幹細胞，最早由日本學者山中伸彌的研究團隊於2006年發現。山中伸彌團隊在發表iPS誘導技術時使用實驗材料爲小鼠成體細胞。2007年，研究人員又證明iPS誘導技術可以應用於人體細胞。最初由山中伸彌團隊發現的誘導方法是透過慢病毒載體將Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四種轉錄因子(OSKM被稱為山中因子)基因轉入成體細胞將其轉化爲類似於胚胎幹細胞的多能幹細胞。
        人類的iPSC可以分化成為多種不同的胎兒細胞類型。iPS細胞在疾病發展和治療藥物的研究很有價值，並且它們可以具有在移植醫學未來用途上。
  3. 幹細胞之分離技術：
    不同的幹細胞有不同的特異性表面抗原或分化標誌，因此，可用特異性抗體的親和性管柱 (affinity column) 與流式細胞分類儀(flow cytometer)加以分離純化。
    以血液幹細胞的純化為例：它是利用一種新的血液幹細胞分離技術，來達到血液幹細胞純化的目的。
    • CD34是血液幹細胞的一種細胞分化標誌的表面抗原，絕大多數的血液惡性腫瘤細胞都不含此種抗原，因此，臨床上我們便可以透過利用此種表面抗原的細胞篩選技術來純化血液幹細胞。
    • CD34血液幹細胞分離系統，目前臨床市面上常使用細胞純化機。此種臨床細胞分離系統（Clini MACS）是一種由永久磁鐵，一個蠕動推進幫浦及一組控制閥門所組成，由電腦控制的全自動操作機器，利用磁性分離細胞篩選技術的系統，在臨床上可以利用此分離技術作為CD34陽性細胞的分離並提供良好的細胞純度及活性。
    • 在篩選過程中，乃是利用鼠抗人類CD34抗體與鐵菌葡萄聚糖分子共價結合的免疫磁珠，經過磁性標記後，系統自動將CD34陽性細胞留存於含有磁性的分離柱上，之後將磁力移除可使分離柱上脫離出被留存的細胞，再經過清洗即可完成CD34陽性細胞收集。
    • 完整的細胞分離只須要3小時即可完成。
  4. 細胞治療的定義：
    根據衛生福利部食品藥物管理署所定義的細胞治療：「使用取自病患同種自體、同種異體或異種異體或其他經中央主管機關核准之體細胞或幹細胞，並經體外培養後所衍生的細胞，以達到疾病治療、診斷或預防目的之醫療技術。」
擬答
《題型解析》 iRNA、shRNA與microRNA三者都是干擾RNA，由上課中灌施的圖解影像，就很容易敘述其原理、技術差異與優缺點，也因此可以取得高分，甚至滿分。
  1. RNA interference（RNAi）
    RNA interference（RNAi）指的是RNA干擾，是RNA研究的聖杯。
    RNAi為RNA interference的簡稱，是一種可造成RNA降解（RNA degradation）進而導致該RNA分子失去功能的一種作用，此作用係透過小片段之RNA分子（約21 - 23 核苷酸，稱為small interfering RNA，簡稱siRNA）結合到與其序列互補之RNA上，形成雙股RNA，引發連串雙股RNA分解與合成放大作用，造成該特定基因失去功能。RNAi亦可稱為轉錄後基因沉默作用（post transcriptional gene silencing, PTGS），係因RNAi作用於基因轉錄為mRNA後，透過降解作用，使得mRNA無法轉譯成蛋白質，而產生該基因靜默現象。
  2. siRNA、shRNA與microRNA（miR）抑制基因表現方式在原理、技術方法的差異與抑制基因表現的優缺點
    1. siRNA (small interfering RNA)：
      siRNA (small interfering RNA)是小片段干擾RNA現象，合成35 nt 左右與標的基因互補的外源 dsRNA送入細胞質內，或RNA病毒感染或干擾素作用，在細胞質內誘導RNAase III-like specific dsRNA endonuclease Dicer，Dicer將dsRNA切成21-23 nt 長度的雙股RNA (稱為小干擾RNA)，Dicer具有helicase功能，將dsRNA鬆開為ssRNA，單股siRNA結合GTP/Mg2+/ Dicer/Argonaute形成RISC 複合物(RNA induced silence complex)，進一步結合到細胞質內標的轉錄RNA分子，利用Argonaute的dsRNA specific endonuclease作用，水解標的mRNA，使得該基因無法轉譯出蛋白質，同時，siRNA也可以大量複製，使得此種RNA干擾效力更大，引發的廣泛存在於生物體內的序列特異性基因轉錄後的基因沉默過程，這是siRNA干擾轉錄RNA的分子機制。
      優點
      1. 針對標的基因合成外源性互補dsRNA或者利用誘導dsRNA的干擾素或者RNA病毒感染。
      2. RNAi作用的專一性極高，因此僅能對於RNA序列相似度極高的病毒具有效力，而對於同一屬卻不同種的病毒通常是無效的。
      缺點
      1. siRNA在細胞質內穩定度差，容易被降解。
      2. RNAi並不一定有效，且其效能通常與siRNA的表現量息息相關，在早期的研究中，經常發現僅有不到1%的轉殖成功，可表現出基因靜默現象。
      3. siRNAs可能在细胞质中降解，導致脱靶效應。
  3. shRNA (short hairpin RNA)：
    小髮夾RNA（short hairpin RNA，縮寫shRNA）是一種形成急轉彎（hairpin turn）結構的RNA序列，可以經由RNA干擾（RNAi）使基因表現沉默化。shRNA可利用人工合成的載體(U6 promoter-----sense ---loop---antisense)導入細胞當中，sense 25-29 nt, 不配對的loop 4-23 nt, antisense 25-29 nt,並藉由細胞質內U6啟動子(RNA polymerase III起動)來確保shRNA的表現。另外，shRNA在細胞質內可經由Dicer切割轉變成為21-23 nt的siRNA。
    shRNA為一種有髮夾狀結構的RNA序列，可利用載體導入細胞中，並藉由U6或H1啟動子來確保shRNA的持續表現，shRNA可切割產生siRNA，並經由RNA干擾（RNAi）使基因沉默化。
    優點
    1. 可以利用人為意志合成質體DNA (U6 promoter-----sense ---loop---antisense)，由細胞質內RNA Pol III負責轉錄shRNA。
    2. shRNA操作簡便。
    3. 基因knockout基因很高，功能逺高於siRNA/miRNA。
    4. 基因特異性，用於基因治療、控制病原菌、病毒、疾病與腫瘤。
    缺點
    1. 由於shRNA是以質體的形式存在，所以對於難轉染的细胞來進行，難度就大大提高，基本上無法形成穩定干擾的細胞系。
  4. microRNA (miR)：
    小分子核糖核酸（microRNA, miRNA），又稱微RNA（微核糖核酸），是真核生物中廣泛存在的一種長約21到23個核苷酸的RNA分子，可調節其他基因的表達。miRNA來自一些從DNA轉錄而來，但無法進一步轉譯成蛋白質的RNA（屬於非編碼RNA）。miRNA通過與目標mRNA結合，進而抑制轉錄後的基因表達。
    細胞核內基因3’端非轉譯區轉錄pri-miRNA長度大約為500~3000個鹼基，pri-miRNA經過Dosa/Pasha一次加工後，成為70-90 nt pre-miRNA(即microRNA前體)，帶有髮夾結構；pre-miRNA再經Exportin/Ran送入細胞質，經過Dicer酶酶切後，成為長約21 – 22 nt的成熟miRNA。在細胞質內與siRNA同樣的經GTP/Mg2+/ Dicer/Argonaute形成RISC 複合物，最後由Argonaute將標的轉錄mRNA3’端非轉譯區降解，而無法轉譯出蛋白質，造成基因沉默化。實際研究中，pre-miRNA應用最早，也最廣泛。
    優點
    1. 在大多數生物體中，miRNA相對於mRNA與蛋白質來說數量較少，然而一個miRNA可能調控多達數百個mRNA，影響重大基因表現網路。
    2. 由於miRNAs在調節基因表達中有重要作用，所以異常的miRNAs 表達可以作為多種疾病的生物標題物，如神經退化性疾病、糖尿病、心血管疾病，甚至是免疫性疾病。
    3. miRNA是内源性的，由非編碼的pri-mRNA經過剪切加工而成，是生物體長期進化過程中自己形成的一套調控系統，在生物體內的表達具有時間性、保守性與組織特異性。
    缺點
    1. 屬於內源性基因，無法人為控制。
擬答
《題型解析》：詳見志聖講義1A p.57~58
  1. human orthotopic xenograft models
    此為人類原位異種移植（xenograft model）。
    1. 原位模式(Orthotopic model)是指癌細胞移植到動物體內的位置，就是原來癌症發生的位置。例如血癌就是在血液中產生癌症，肺癌就是在肺中產生腫瘤，口腔癌就是在口腔中產生腫瘤。利用原位移植的模式，其優點是發生癌化部位接近人類發生部位，可觀察其癌症發生的進程與相關基因的表現。而缺點在於建立此模式選擇的部位有限，技術也需較好。
    2. 異種移植(Xenograft Model)是指所移植到動物體內的癌細胞，不是同種動物所產生的，例如將人類的骨癌細胞株U2-OS細胞，以皮下注射方式注入BALB/c nu/nu裸小鼠中，便能成功地誘導BALB/cnu/nu裸小鼠皮下產生腫瘤。利用異種移植的模式，其優點是人類的癌細胞可在免疫功能缺乏的小鼠中，產生腫瘤，不用侷限在某些癌細胞。
  2. SPF實驗動物
    實驗動物根據對於微生物的控制狀況，一般分為四個等級：
    • 第一級是無菌動物﹙Germ Free Animal﹚
    • 第二級為特定病原動物﹙Gnotobiotes﹚
    • 第三級即為無特定病原（SPF）動物
    • 第四級實驗動物稱為一般動物﹙Conventional Animal﹚
  3. 無特定病原（Specific Pathogen Free, SPF）動物屬於第三級
    指實驗動物沒有附存特定微生物或寄生蟲的動物，由前述無菌動物或特定病原動物而來，飼養於隔離系統中，使特定病原隔離於外，但允許常態微生物自然定著，生產成本亦相當高。
  4. 二種在生物醫學研究領域常用之免疫缺陷純品系小鼠，及其特性
    科學家利用免疫缺陷小鼠（immunodeficient mice）的特性，植入人類幹細胞於小鼠體內，建構模擬人類免疫系統的擬人化小鼠（humanized mice），促成生物醫學相關領域的研究蓬勃發展。免疫缺陷小鼠的發展，起源於遺傳性基因突變的發現，早期較廣為應用的有裸鼠(nude mice)和SCID (severe combined immunodeficiency)小鼠。
    1. 裸鼠(nude mice)
      裸鼠是目前癌症研究領域中，不可缺少的動物模型。在腫瘤學、免疫學、藥理學與生物製劑的安全性評估與活性篩選實驗，具有特殊的價值。無毛小鼠沒有胸腺，缺乏T細胞，是第11對染色體上nu 基因突變產生，裸鼠大量地被使用於異種移植（xenograft model）的研究，成為癌症研究領域中不可或缺的動物模式。但裸鼠的免疫系統仍保有B細胞、NK細胞和巨噬細胞，並非所有實驗材料都能移植成功。
    2. SCID (severe combined immunodeficiency)小鼠
      重症聯合免疫缺陷小鼠(SCID)包括CB-17/SCID小鼠，攜帶有一遺傳性染色體隱性突變的基因(scid)，為重症聯合免疫缺陷小鼠，其特性包含T細胞及B細胞皆有缺陷，因此可接受外來移植的細胞，較不會有免疫排斥現象，適合於異種移植(Xenograft Model)，但須在無菌條件下飼養。但SCID小鼠體內的先天性免疫系統仍保有高度活性，限制人類細胞植入後的增殖。
擬答
《題型解析》：2020年基因剪刀手CRISPR/Cas9編輯技術獲得諾貝爾化屬獎，過程簡單，容易描述。可以取得高分20-25分。
  1. 缺乏CCR5則可能免於HIV感染的原因
    CCR5（C-C chemokine receptor type 5）為趨化因子受體5，也稱為CD195，CCR5是一種G蛋白偶聯受體，屬於整合型膜蛋白的β趨化因子受體家族成員。
    • CCR5是白血球表面的一種蛋白質，因此也稱為CCR5蛋白質。CCR5主要在T4細胞、巨噬細胞、樹突細胞、嗜酸性球、小膠質細胞和乳腺癌或前列腺癌的細胞亞群中表現。
    • 1983年科學家篤定HIV是造成後天免疫缺乏症候群的罪魁禍首之前，就有許多研究人員發現HIV 特別偏愛免疫系統裡的CD4 T細胞。HIV病毒藉由本身表面的gp120與gp41兩種醣蛋白而得以入侵T細胞。HIV病毒先靠gp120醣蛋白和T細胞的CD4接觸，兩相結合之後，會造成gp120構型上的改變，使其上頭的V3可變環區（variable 3 loop）能和另一個T細胞表面蛋白質（CCR5或是CXCR4）結合，CCR5做為Co-receptor，進而使得HIV表面的gp41醣蛋白得以接觸到T細胞細胞膜，在其上打洞，好讓HIV把自己的遺傳物質感染到T細胞內。因此，HIV病毒要感染T細胞，必須湊足T細胞有表達CD4、與 CCR5（或是 CXCR4）的條件。
    • 愛滋病HIV要進入並感染宿主細胞的過程需要藉助CCR5蛋白質，控制CCR5蛋白質的基因稱為CCR5基因，該基因在人體內的基因座是3p21.31。某些人群的基因組中含有此基因的一個突變型，稱為CCR5-Δ32，與普通CCR5基因相比，有一段長為32鹼基對的缺失，其表現產物無法被HIV識別和結合，因此可對R5型HIV引起的愛滋病免疫。
  2. CRISPR/Cas9基因編輯技術的原理
    CRISPR/Cas9的全名為「常間回文重複序列叢集關聯蛋白」（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/ CRISPR associated protein 9），CRISPR 是1987年日本科學家在大腸桿菌中發現。後來發現，許多細菌都有CRISPR，它是細菌免疫系統的一種機制，可以記憶曾經來犯的病毒。
    CRISPR/Cas9整個系統需要三大要件：
    1. 欲編輯剪切的標的DNA已知序列
    2. 與標的DNA已知序列互補的引導 guide RNA (gRNA)
    3. 特異性分子剪刀手Cas9 endonuclease。
    以DNA片段（Spacer）當模板，打造一條互補的引導gRNA，透過一個來自於化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9蛋白與一個 gRNA 形成一個複合體，該複合體會與互補的DNA進行辨識。辨識DNA序列最主要的是透過 gRNA前端(5端)的20 nt長度的序列，稱之為Protospacer。緊接在後的三個核苷酸序列(NGG) 則稱之為Protospacer adjacent motif (PAM)，主要是讓Cas9辨識並且切割DNA。目前發現在細胞實驗中，野生型Cas9存在較高的脫靶可能性，主要原因是當 Protospacer 的5端序列約5-7 bps的核苷酸產生變異時，野生型的Cas9 蛋白仍然可以對DNA進行辨識與切割。
  3. CRISPR/Cas9基因編輯技術的的倫理問題、衝擊與爭議
    基因編輯自帶雙刃劍屬性，問世後爭議從未間斷。改變遺傳信息，等於修改了「天命」、「天條」，尤其在人類基因編輯領域，倫理問題尤其突出。
    正因為這把剪刀之鋒利，其安全性、有效性尚難確定，用在胚胎基因編輯上，實驗室操作尚可控制而安全性和穩定性仍未過關，如果允許用於臨床，則可能引發一系列安全風險和倫理問題。
    專家擔心，改變胚胎的基因組可能會造成意想不到的傷害，比如意外改變了其他重要基因，或無意中引發癌症，不僅對個體有傷害，而且被改變的DNA代際相傳，對繼承這些基因遺傳的子孫後代都會造成傷害。科學家們警告說，修改人類基因的研究可能會對未來的世代產生未知的影響。
    2018年，中國科學家賀建奎宣佈首例免疫艾滋病的基因編輯嬰兒成功誕生的消息，利用CRISPR/Cas9編輯技術，將HIV感染T細胞上CCR5 coreceptor剪切，其震撼強度之大至今餘波蕩漾。

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