志聖食品技師
105第二次食品微生物學 試題詳解
擬答
完全命中100%，詳見105志聖阮籍老師 食品微生物學講義A01，P.193-194。
㈠ 「活而不能培養微生物」與「代謝受傷微生物」：
  1. 「活而不能培養微生物」 (Viable but non-culturable microorganisms，簡稱VBNC)是指菌體類似休眠的一種狀態，在實驗室常規培養基上無法形成菌落，但菌體仍是活的而非處於死亡狀態。VBNC首被發現於海洋弧菌，霍亂弧菌O139 (Vibrio cholerae O139)，當海水溫度被降至5℃，弧菌成為VBNC狀態。此時，plate count者很低，但由以acridine orange之鏡檢法 （可區分死、活），菌數卻非常高。當溫度升高，VBNC即可恢復原來狀態，仍具致病力，僅毒性較低。
  2. 代謝受傷微生物（metabolically injured microorganisms）微生物受次死環境侵害而影響其代謝（但未死亡）， 故在選擇性培養基上無法生長，但可在非選擇性培養基生長，故可將樣品分別選擇性及非選擇性培養基分析之，二者之差，即為Injured MO。
  3. VBNC與代謝傷害性菌不同，後者可於非選擇性培養基修護。

㈡ 「代謝受傷微生物」之存在對食品病原菌檢測結果
食品病原菌之檢測管制常為「不得檢出」，但因測試樣品曾經凍藏、或加熱等處理，可能含有受傷之病原菌（未死），造成檢驗誤差。
因此通常需將樣品均質液放在適當非選擇性培養液中短暫時間（1~4 h），使受傷菌復原，再以選擇性培養基分析之。
擬答
完全命中100%，詳見105志聖阮籍老師 食品微生物學講義A01，P.149-156。
平板計數法是食品檢驗中最常用來測定細菌數量的方法，將樣品打碎均質後，經一系列稀釋，再塗於滅菌的平板計數培養基(plate count agar, PCA)上培養，計算活菌菌落述的方法。因培養細菌時通常置於有氧環境下，故又稱為好氧性平板計數 (aerobic plate count, APC)。測得總平板菌落數(total plate count, TPC)，一般稱為總菌數、生菌數。將樣品適當稀釋後，接種在固體洋菜培養基上，經培養後，根據培養基上長出的可見菌落(colony)數來推算樣品中所含細菌量，並以菌落形成單位(colony forming unit，CFU)來做為計算的單位。
結果能代表食品中的菌數，是基於二個假設的成立：
  1. 所用培養基可以讓該微生物生長。
  2. 生長的微生物可以長成菌落。
平板法的二種不同操作方法
  1. 傾注平板法(pour plate method)：
    將1 ml的樣品稀釋檢液注入無菌培養皿中，再倒入約12~15 ml已滅菌且冷卻至45~50℃的液態洋菜培養基，迅速搖動，使樣品稀釋檢液與培養基混合均勻，待其凝固後，倒置於培養箱中進行培養，菌落長在培養基表面及下層之間，稱為傾注平板法。每一種稀釋檢液至少作二重複。
  2. 塗佈平板法(spread plate method)：
    將一系列的樣品稀釋檢液，準確吸取0.1ml置入已凝固的洋菜培養基表面，利用L-型玻璃無菌塗抹棒在平板上均勻進行塗佈，菌落只生長在培養基表面，稱為塗佈平板法。每一種稀釋檢液至少作二重複。
擬答
完全命中100%，詳見105志聖阮籍老師 食品微生物學講義A01，P.9-12。
  1. 牛乳製作乳酪的原理：
    菌將乳汁中的乳糖代謝產生乳酸，乳蛋白因pH值下降而凝固，經脫水、加鹽與加入風味料進行熟成等步驟而製成之發酵乳製品。
    新鮮乳酪為牛乳的9%。不同的乳酪有其特殊之製程：牛乳先經殺菌（62.5℃，30分鐘），迅速冷卻，再加入適當之菌種 (2%)，進行乳酸發酵，於酸度約0.2-0.8% 時添加凝乳酵素(rennin)加速乳蛋白的凝結，凝乳經切割、燙洗、除水、成形、鹽漬、熟成後即為成品。
  2. 共同操作步驟：
    乳酪(cheease)可以分為上百種，乳源（產乳動物所吃的食物也有差異），是否使用巴斯德消毒法，乳脂含量，細菌和霉，處理方法和發酵決定了他們的形狀，口感，及味道。起司可以用香草，香料，或者煙燻來調味。起司中的黃色和紅色，例如紅萊斯特起司，是由於添加了胭脂樹的種子。
    各種乾酪有其獨特的製造法，但從原料直到生乳酪形成，卻有如下共同的製造過程：
    1. 原料乳的處理：檢驗、標準化、淨化、殺菌。
    2. 菌酛的添加：乳酸發酵。乳糖經乳酸菌作用產生乳酸而形成低pH的環境，可有效抑制病原菌與腐敗菌的生長。當環境中的pH低於蛋白質的等電點時，蛋白質的結構會變得不穩定而發生沈澱形成凝乳。酸化可加速凝乳塊中乳清的排除，降低乾酪水分，進而延長保存期限。
    3. 凝乳酛的添加：凝乳化（curdling）、凝固（coagulation）、放置（sett-ing）。乾酪的最終組織結構主要由凝乳塊的最終pH值決定，當pH值超過2-5時，蛋白質仍能維持原有的分子結構（球形凝聚物，直徑為10-15 nm），因此乳酪為有彈性的組織結構，可塑性高；當pH值降至8以下時，蛋白質之球形凝聚物的直徑降至3-4 nm，組織結構變得較短、黏稠度低或易粉碎。
    4. 凝乳的裁切（cutting）。
    5. 凝乳的蒸煮與攪拌（cooking and stirring）：蒸煮及攪拌、皺縮凝乳。
    6. 乳清的排除（dipping, draining, whey off ）
    7. 乳清的堆積（matting, cheddaring）：堆積或粉碎
    8. 定型（hooping）：壓榨（pressing）
    9. 加鹽（salting）：濕鹽法、乾鹽法
    10. 熟成（ripening, curing）
擬答
完全命中100%，詳見105志聖阮籍老師 食品微生物學講義A02，P.16-17、P.80-82。
㈠ 何謂 Kefir：
將牛乳或羊乳煮沸後，冷卻至25℃接種混有乳酸菌與酵母菌之克弗麴 (Kefir grain)於23~25℃保溫過夜，直至乳酸濃度達0.68~0.9%，經過濾後即得具奶油均勻特性及發泡性的酒精發酵乳(alcohol fermented milk)，是謂克弗爾 (Kefir)。克弗爾粒在牛乳中會同時進行乳酸菌的乳酸發酵和酵母菌的酒精發酵，而形成獨特的克弗爾發酵乳。在克弗爾成品中，各種乳酸菌的含量大概有 106~ 109菌數／ml，而各類酵母菌的含量則在106~ 108菌數／ml之間。乳酸菌代謝所產生的酸，再加上酵母代謝產生的二氧化碳和微量的酒精，使克弗爾同時具有酸味、淡淡的酒精風味和碳酸的刺激風味等獨特的味道，所以又有「牛乳酒」的別名，也經常被稱為「香檳酸乳酪」。
克弗爾 (Kefir)發酵的主要微生物：
  1. 乳酸菌：
    包括乳酸鏈球菌、嗜酸乳酸桿菌、短乳酸桿菌、酪蛋白乳酸桿菌與克弗爾白念珠球菌。產物為乳酸、醋酸、雙乙醯等
  2. 酵母菌：
    主要種類有克弗爾囊球酵母菌、啤酒酵母菌和克弗爾念珠菌等。產生的二氧化碳和微量的酒精。

㈠ 微生物所引起之「食品腐敗」:
  1. 食品腐敗(putrefaction)指食物中蛋白質成分被微生物破壞之過程，蛋白質被分解成H2S、硫氫化物或胺類等。
  2. 造成蔬菜「細菌性軟腐病（Bacterial Soft Rot）」之主要微生物：
    蔬菜類之腐敗以存在蔬菜表面之微生物為主，來自土壤及空氣中，由於蔬菜之pH值大多屬於中性，因此細菌及真菌皆易造成腐敗。
    常見蔬菜腐敗的部位以細菌性的Erwinia及Pseudomonas所造成的細菌性腐敗(bacterial soft rot)最常見。
  3. 蔬菜腐敗之情形：
    由於細菌性果膠分解作用(pectinolysis)引起的植物組織軟腐現象。蔬菜中腐敗性的微生物主要以好氧菌或兼性厭氧菌為主，此乃因為蔬菜的氧化還原電位較高，其中最明顯的例子就是Erwinia等屬細菌所造成的細菌性腐敗(bacterial soft rot)，主要是由噬胡蘿蔔伊文氏桿菌(Erwinia carotovora)和邊緣假單孢菌(Pseudomonas marginalis)所造成的腐敗，造成軟腐現象、均質性黏糊狀，有時生出臭味及吸水性的外觀。
擬答
完全命中100%，詳見105志聖阮籍老師 食品微生物學講義A01，P.182-184。
聚合酶鏈鎖反應(PCR)為用以快速擴增DNA片段的方法，PCR這項技術是由凱利•穆利斯(Kary Mullis)在1986年發展出，利用一種人工和反覆相同程序的方法，並利用一種特殊的酶—即耐熱性DNA聚合酶來擴增特定的DNA片段。
其應用原理包括三個重複進行的步驟：三個重複步驟形成一個循環。
  1. 變性(denaturation)：利用加熱的方式，一般為95℃加熱1分鐘，將欲擴增片段的雙股DNA模板(template)分開成單股。
  2. 黏合(annealing)：自動降低反應溫度到42-50 oC，2分鐘，使已知序列的DNA引子(primer)黏合至特定互補序列的單股DNA模板上。
  3. 延伸(extension)：利用耐熱性DNA聚合酶例如Taq DNA polymerase自引子的3'-端進行DNA複製，合成新的雙股DNA。此階段的作用溫度是以DNA聚合酶的最適反應溫度為主，一般為72℃，2分鐘。
    PCR便是以變性－黏合－延伸等三個步驟為一循環(cycle)，由於新合成的DNA片段亦可做為下一循環的模板DNA，因此，每一循環以2n放大，在重複進行超過25個循環後，將可至少獲得約225或106倍的擴增效率。如此大量的DNA擴增片段(PCR產物），便可以DNA電泳(DNA electrophoresis)來進行確認與分離純化。

多重PCR(multiplex PCR)，又稱多重引物(primer)PCR或複合PCR，它是在同一PCR反應體系裡加上二對以上primers，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，其反應原理，反應試劑和操作過程與一般PCR相同。一般PCR僅應用一對primer，通過PCR擴增產生一個核酸片段，主要用於單一致病因子等的鑑定。
產生腸毒素stx1 及 stx2 的大腸桿菌的多重聚合酶鏈鎖反應(Multiplex PCR)：
  1. 抽取食品中DNA (含微生物或大腸桿菌DNA)
  2. 合成stx1 及 stx2的特定DNA 引子
  3. 進行PCR (含有stx1 及 stx2的特定DNA 引子、食品中DNA、Taq DNA polymerase、PCR buffer、dNTPs、³²P-α-dATP、Mg₂₊、thermal cycler控溫，進行30循環PCR。
  4. Run洋菜膠DNA電泳與X-光片顯影技術，確定是否有產生腸毒素stx1 及 stx2 的大腸桿菌。

各年度試題

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