志聖
食品技師

106第二次
食品微生物
試題詳解

擬答
命中特區：詳見志聖食品微生物學A01，P167-169，P147-161

ATP 測定法計算菌數是間接計數法：
細菌細胞內的ATP含量約為10-18~10-17 mol/cell。另一方面，ATP會在細胞死亡後二小時內降解消失。因此，藉由檢測樣品中的ATP含量，可大致估算出樣品中的總生菌數。
優點：
1. 快速 (5 min內)
2. 操作簡便
3. 攜帶方便
4. 可就地即時檢測
5. 精確度大
6. 重複性高
缺點：
1. 易受檢測物中非微生物來源之ATP的干擾
2. 受螢光物質的干擾。
其它四種計算食品中菌數的方法：
1. 直接鏡檢計數(direct microscopic count method, DMC)
  將稀釋後定量的樣品直接置於載玻片上，經必要染色後，於顯微鏡下以高倍率鏡頭直接計數特定範圍內的菌量，通常是計算載玻片上任意25個顯微鏡視野的微生物數量，進而推算出原樣品中每公克或每毫升的含菌量，此法稱為直接鏡檢計數法。
2. 標準平板計數法(standard platw count, SPC)
  標準平板計數法是食品檢驗中最常用來測定細菌數量的方法，將樣品打碎均質後，經一系列稀釋，再塗於滅菌的平板計數培養基(plate count agar, PCA)上培養，計算活菌菌落述的方法。因培養細菌時通常置於有氧環境下，故又稱為好氧性平板計數 (aerobic plate count, APC)。
  測得總平板菌落數(total plate count, TPC)，一般稱為總菌數、生菌數。
  標準平板計數的原理是將樣品適當稀釋後，接種在固體洋菜培養基上，經培養後，根據培養基上長出的可見菌落(colony)數來推算樣品中所含細菌量，並以菌落形成單位(colony forming unit，CFU)來做為計算的單位。
3. 膜過濾法Membrane filtration method
  於測定含菌量低的樣品，如空氣中或水中的微生物數目，常使用膜過濾法。
  將定量樣品通過孔徑大小為0.45μm的濾膜，由於濾膜的孔徑很小，可以截留樣品中的微生物，過濾後將濾膜置於適當的培養基上培養，微生物便可利用從培養基中擴散至濾膜上的水分和養分生長成可計數的菌落。進而推算出樣品之含菌量。
4. 最確數法MPN, The most probable number method
  最確數法適用於檢測微生物含量小於100 cell/g 的食物樣品，尤其是牛奶、水、以及含有顆粒成分者，會影響平板計數正確性的食品。只有活菌才可被此法檢測出，因此，其屬於檢測樣品生菌數的方法之一，其可分為三支法及五支法。
  最確數法的原理是將液態樣品經過數次的連續稀釋，直到稀釋樣品中不再含有欲檢測的微生物，然後，根據這些不同稀釋倍數中出現微生物生長（通常以濁度計算）的管數，便可對原樣品中的菌數作統計學上的估計。

擬答 2017年10月初諾貝爾獎公布後，上課補充說明。

電子顯微鏡的分類：
1. 穿透式電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope, TEM)
2. 掃描式電子顯微鏡 (Scanning Electron Microscope, SEM)
3. 冷凍電鏡（cryo-EM）的冷凍電子顯微鏡技術，是指低溫下使用透射電子顯微鏡觀察樣品的顯微技術。2017 年諾貝爾化學獎得獎主題。
電子顯微鏡的成像原理：
1. 利用穿透式電子顯微鏡(TEM)可以直接獲得一個樣本的投影。在這種顯微鏡中電子穿過樣本，因此樣本必須非常薄。樣本的厚度取決於組成樣本的原子的原子量、加速電子所用的電壓和所希望獲得的解析度。樣本的厚度可以從數奈米到數微米不等。原子量越高、電壓越低，樣本就必須越薄。經改變物鏡的透鏡系統人們可以直接放大物鏡的焦點的像。由此人們可以獲得電子衍射像。使用這個像可以分析樣本的晶體結構。
  工作與成像原理：在真空條件下，電子束經高壓加速後，穿透樣品時形成散射電子和透射電子，它們在電磁透鏡的作用下在螢光屏上成像。電子束投射到樣品時，可隨組織構成成分的密度不同而發生相應的電子發射，如電子束投射到質量大的結構時，電子被散射的多，因此投射到螢光屏上的電子少而呈暗像，電子照片上則呈黑色。
2. 掃描式電子顯微鏡(SEM)中的電子束儘量聚焦在樣本的一小塊地方，然後一行一行地掃描樣本。入射的電子導致樣本表面散發出電子，顯微鏡觀察的是這些每個點散射出來的電子。由於這樣的顯微鏡中電子不必透射樣本，因此其電子加速的電壓不必非常高。場發射掃描電子顯微鏡是一種比較簡單的電子顯微鏡，它觀察樣本上因強電場導致的場發射所散發出來的電子。
  (SEM)。SEM主要用於觀察樣品的表面形貌、割裂面結構、管腔內表面的結構等。
  工作與成像原理：掃描電鏡是利用二次電子信號成像來觀察樣品的表面形態。用極細的電子束在樣品表面掃描，激發樣品表面放出二次電子，將產生的二次電子用特製的探測器收集，形成電信號運送到顯像管，在螢光屏上顯示物體。(細胞、組織)表面的立體構像，可攝製成照片。
電子顯微鏡術如何應用在食品微生物
電子顯微鏡則利用電子放大物體。光學顯微鏡大多只能放大1000倍，而電子顯微鏡可放大至10萬倍或更高。
電子顯微鏡的顯微鏡的解像力可達3Å，電子光束擴大檢體的影像，結聚至鏡筒末端之螢幕上，可以在投影的終端機上檢視。可以檢視很小的菌體，如病毒及菌體之超微小構造。
應用電子顯微鏡以超顯微（ultrastructure）角度，被使用於食品微生物包含病毒、細菌、黴菌、酵母菌、原蟲等，內部組成與外部立體結構的解析。
電子顯微鏡主要以針對病毒為主，因為病毒大小僅有數nm大小，故需要電子顯微鏡高解析度來幫忙。樣品以負染色法處理，目前一般均可利用此法鏡檢，直接依其型態檢出病原達到確認目的。其操作方法是將樣品以低速及高速離心純化，利用等量蒸餾水與2%磷鎢酸混合滴於經Collodion被覆，炭膜蒸鍍之400 mesh銅網上，以濾紙吸乾即可鏡檢。
1. TEM，穿透式電子顯微鏡欲得倍率，須進行超薄切片及複雜之標本製備程序，也因而降低物質影像之實體感。TEM一般用以觀察細胞以及大分子物質的構造，可觀察 0.1~0.2 nm 的顆粒。
2. SEM，掃描式電子顯微鏡標本製備則較為簡單，而且不須進行超薄切片。放大倍率可以高達100萬倍。然而它們的放大影像之所以迷人，乃在於它能以不到100A（1A =10-8cm=0.1奈米）的解析度，精準地描繪出物體的表面。SEM也可以辨識出樣品的組成原子。SEM可以準確地觀察物質表面的微細三度空間構造，及加接電子探束（Electron Probe）以探測細胞之成份，一般可觀察 5~10 nm 的表面構造。
3. Cryo-EM 是穿透式電子顯微鏡的一種。最大的特色就是樣本是被快速冷凍而不經過染色與固定，以微生物巨分子的蛋白質與核酸等樣本來看，更接近原本的生理條件。

擬答 命中特區：詳見食品微生物學A01，P26，P54-55

菌種特性與李斯特菌症 (Listeriosis)：
李斯特菌屬Listeria是格蘭氏陽性菌G(+)，不產孢子，短桿菌，過氧化氫酶陽性、氧化酶陰性，並具部份溶血的特徵，能摧毀紅血球。是目前發現唯一可以在低溫冷藏下生長良好的病原菌，在0oC仍可生長，是5oC冷藏主要菌種。
因此菌中毒稱為李斯特菌症(Listeriosis)，導致一系列症狀，包括肺炎、發熱、咽喉炎、腹瀉、全身疼痛、腦膜炎、敗血病，嚴重時可引致死亡。
傳染途徑單核李斯特菌屬Listeria monocytogenes在自然界中分布很廣，在土壤、河流、動物的草料中皆有其蹤跡，也可以寄生於動物、兩棲類及鳥類的腸道中，並可由其糞便中分離出來。
由食物進入口腔到達腸胃道是單核李斯特菌屬侵犯人體的主要途徑，但也可經由傷口感染，尤其是與受感染動物工作者。單核李斯特菌屬可藉由相當多種的食品傳染，如蔬果（尤其以糞便當肥料）、肉類及水產品等，但最重要的帶原食品為乳製品，可能因為在飼養牛的草料中含有單核李斯特菌屬，使得在牛的排泄物中也含有多量的菌體，而在擠乳過程中遭受污染。
目前對單核李斯特菌屬的最低感染量並不十分確定，推估可能低於約100個菌體即可引起感染症狀。
單核李斯特菌屬的致病原因為會產生溶血素(haemolysin)，又稱為李斯特菌素(β-listeriolysin)，失去產生溶血素的單核李斯特菌屬便失去致病力。
李斯特菌症治療：
1. 抗生素治療以Ampicilin 為第一優先考慮的藥物，Penicillin 亦可使用。
2. Ampicillin 或Penicillin合併Gentamicin 有相加成的效果。
3. Imipenem 及Meropenem 也有效，但要小心抽搐的副作用。
4. 抗生素劑量不論是否有腦膜炎，均建議使用腦膜炎的劑量。
5. 所有腦膜炎皆應治療21天。
6. 單純菌血敗血症可以只治療14天，但仍需要根據病人的臨床狀況來調整。
7. 要注意可能併發症如腦膿瘍，若有則需治療最少六週，並定期追蹤腦斷層檢查。若併發心內膜炎則應治療4到6週。
李斯特菌症預防方法：
巴斯德殺菌法（62.7℃，30分鐘）不能將單核李斯特菌屬完全殺滅，而在菌數高的情形下採用高溫短時（72.6℃，15秒）也無法將其完全滅絕，而單核李斯特菌屬又可在低溫儲存下繼續生長，進而造成食用者的感染。
由於單核李斯特菌屬於自然界中分布很廣，很難加以預防，必須從農場餵養牲畜的飼料加以管制，進而食品製造時確實遵守危害分析重要管制點系統(hazard analysis and critical control point, HACCP)的規定，才可加以防止。
高危險群的消費者最好避免食用生食及可能含單核李斯特菌屬量高的食品，如軟乳酪、含肉泥的餡餅等，對於冷藏的食品及一般食品都必須充分加熱後才能食用。
1. 建議肉類務必煮熟，不要喝生的牛奶，食用蔬菜水果前必須把它清洗乾淨。
2. 工作人員應穿戴手套及護眼罩操作。
3. 有懷孕之工作人員應有充分的知識了解其危險性，包括對胎兒危險性。
4. 加強洗手，進食前、如廁後保持個人衛生。
5. 不要進食未經殺菌處理的牛奶或奶類製品、以及來路不明的牛奶。
6. 避免進食未經煮熟之生肉。
7. 生吃的蔬菜、水果要徹底洗淨。
8. 徹底翻熱煮熟經冷藏的食物。
9. 生食和熟食應分開處理，洗淨處理過的刀及砧板並且分開冷藏。
10. 不要碰觸流產的動物屍體，因為他們有可能已被感染。
11. 畜牧業者加強農舍清潔及定期追蹤牛、羊的健康狀況，並於接觸過動物後要加強洗手。

擬答

可可豆發酵過程及巧克力製造方法
1. 取出肉和果實
2. 發酵過程去酸：
  由成熟的可可果實中取得包覆著果肉的可可豆，一起發酵。在低pH的環境內，可可豆內的多酚、醣類、胺基酸、有機酸以及生物鹼，都是最後帶給巧克力各種風味的前驅物。
  1. 開始發酵的前兩天絕大多數是利用酵母的酒精發酵的作用居多：由厭氧生物開始分解果肉的醣類，製造出乙醇跟二氧化碳。
  2. 隨著果肉的消耗，空隙的出現讓空氣進入而開始進行需氧發酵，由細菌發酵製造出醋酸以及使得溫度昇到約45 oC，這樣的環境逐漸使得可可豆失去發芽的能力。
  3. 在果肉持續的發酵過程中，持續的消耗氧氣使得可可豆持續的無氧狀態存在。這狀況持續到發酵第4-5天，果肉毀壞，整體溫度下降，可可豆接觸到空氣最重要的結果就是讓水溶性多酚類轉換為非水溶性聚合物降低了可可豆的澀味。而過度的發酵會使需氧微生物破壞了已經發酵的剛好的可可豆風味。
3. 在陽光下曝曬，將水分從60%降低到6～7.5%。
4. 烘烤、脫皮：好的可可豆要用低溫長時間烘烤，大約100~110oC，烘烤40~50分鐘，慢慢去掉酸味。烘好的可可豆會放進脫皮機，將比較堅硬的外殼去除，裡面的碎粒就是之後要研磨成巧克力的材料。
5. 可可豆脫殼打成碎粒後，放入磨膏機，就會變成我們常見的液體狀巧克力，這個程序至少要耗時72~84小時，最後加糖，放入模子定型，就成為可可磚。
  當您看產品成分中標示70% chocolate (巧克力)，則表示其內容含70% 的可可及可可脂，其於30%為砂糖成份。白巧克力的成分則為僅有可可脂(cocoa butter)、砂糖與牛奶，沒有任何可可液塊 (cocoa liquor，即純可可)的成分，嚴格說起來不算是巧克力。
巧克力對人體健康的功效與營養價值：
許多科學研究已顯示，食用黑巧克力 (可可成分較高) 對心臟有利。
可可中含有黃酮類化合物 (flavonoids)，是一種植物性化學成分，扮演抗氧化劑的角色包括維持低血壓、改善血管內皮功能、減少血栓、氧化和發炎等，來維持心血管的健康。
近10年的研究」指出，可可被研究出的好處有。
1. 提升體內抗氧化能力，防止血膽固醇LDL氧化及脂肪氧化。
2. 抑制血小板凝集，減少血栓發生機會，增加血液流動。
3. 減少自由基產生，保護血管內皮細胞的完整。
4. 提高血中一氧化氮的濃度，可減少發炎反應、保護血管、減少氧化作用，進而達到保護心血管的功能。
5. 可可中含黃烷醇類，屬於類黃酮的一種，多與抗氧化及抗發炎有關，也被認定與抵抗或延緩腫瘤形成有關。

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