109高考衛生技術

生物技術學

申論題

擬答
【命中特區】志聖生物技術學A01, p160-163, p165-166, p76-82
  1. 短干擾RNA (short interfering RNA, siRNA)
    RNA干擾簡稱RNAi (RNA interference)，是一種細胞內RNA干擾現象或系統，能夠干擾標的細胞內特定mRNA，直接降解或抑制進一步的轉譯，因此可以控制基因轉錄後的蛋白質表達，稱為RNA干擾。能夠干擾、控制基因轉錄後的蛋白質表達的小分子RNA，則稱為siRNA或miRNA或人工合成的shRNA等。
    在發育生物學上，常用於線蟲(C. elegans)、果蠅或酵母菌的基因研究，RNA干擾有效的"沈默"特定基因，可以抑制HIV病毒的感染與複製上。
    RNA干擾現象在1998年首度於線蟲中發現，利用雙股的RNA(dsRNA)並將其送到細胞中後，dsRNA會被一種名為Dicer的酵素分解成許多小片斷。這些小片斷的RNA(Short interfering RNA，簡稱siRNAs)結合到特定序列之RNA上，引發RNA序列的降解，使mRNA 無法轉譯蛋白質，造成該特定基因"沈默 (gene silencing)"，失去功能。
    RNAi作用原理與機轉:
    RNA病毒或合成的特異基因dsRNA ，經由感染或其他方法送入標的細胞內，此種dsRNA會誘導細胞內一種稱為Dicer的酵素 (RNase III endonuclease) 的表現，Dicer利用其dsRNA特異內切酶活性將dsRNA切成21-23 nt的小RNA片段，這些小RNA片段被稱為siRNAs (small interfering RNAs)，siRNA的3’端有2個核苷酸的凸出，這些siRNA本身可以大量複製。
    Dicer 結合於siRNA，利用本身的helicase活性將siRNA解開為單股，此時單股的siRNA再結合另一種稱為金羊毛 (Argonaute)的 dsRNA特異內切酶 ，在GTP/Mg2+存在下，siRNA/Dicer/Argonaute/ ATP/Mg2+形成RNA誘導的沉默複合物 (RISC, RNA-induced silencing complex)，RISC會利用它的siRNA片段結合到細胞內轉錄的mRNA互補區，隨後，RISC利用Argonaute RNase III活性，水解細胞內mRNA，使得特異性基因無法進一步被轉譯。此一過程稱為RNA干擾現象，其結果是:特定基因被沉默(gene silenced)或被剔除(gene knock-outed)。
  2. 短髮夾RNA (short hairpin RNA, shRNA)
    短髮夾shRNA(Short hairpin RNA)是2002年Brummelkamp首次使用，在小老鼠U6啟動子之後構建shRNA表現載體pSUPER。含shRNA構建的表現載體pSUPER經送入寄主細胞並表達該載體，證明此種shRNA特異性的踢除哺乳類動物細胞內標的基因，為利用RNAi於特定基因治療研究訂定了基礎。
    U6 RNA由RNA聚合酶 III 轉錄，伴隨其後端的構築shRNA被RNA聚合酶 III所轉錄，因為設計成sense 與antisense的相互配對，二者中間則非互補配對序列，因此轉錄出一緊密的髮夾形狀shRNA。
    shRNA與RNAi/miRNA一樣，都可以誘導標的mRNA的降解，但是shRNA可以經由人為意志，利用基因工程技術，構築強力啟動子表現載體，因此，在應用功能上遠比miRNA要強。
    建構shRNA表現載體時，合成dsDNA片段(含sense-loop-antisense)受控於啟動子，轉錄出25-29 nt的髮夾形shRNA。shRNA是一種形成急轉彎型(hairpin turn)結構的RNA序列，可以經由RNA干擾現象使特異基因沉默化。
    shRNA可利用載體導入細胞當中，如果是接在U6啟動子後，則寄主細胞內的RNA 聚合酶III可以確保shRNA的轉錄。
    shRNA在細胞質內經由Dicer剪切成21-23鹼基的siRNA，與siRNA、miRNA相同的原理，最後以RISC結合降解標的mRNA。
  3. 抗體 (antibody)
    抗體（antibody），又稱免疫球蛋白（immunoglobulin，簡稱Ig），是一種主要由漿細胞分泌，被免疫系統用來鑑別與中和外來物質如細菌、病毒等病原體的大型Y形蛋白質，僅被發現存在於脊椎動物的血液等體液中，及其B細胞的細胞膜表面。抗體能通過其可變區唯一識別特定外來物的一個獨特特徵，該外來目標被稱為抗原。蛋白上Y形的其中兩個分叉頂端都有一被稱為互補位（抗原結合位）的鎖狀結構，該結構僅針對一種特定的抗原表位。這就像一把鑰匙只能開一把鎖一般，使得一種抗體僅能和其中一種抗原相結合。抗體和抗原的結合完全依靠非共價鍵的相互作用，這些非共價鍵的相互作用包括氫鍵、凡得瓦力、電荷作用和疏水作用。這些相互作用可以發生在側鏈或者多肽主幹之間。正因這種特異性的結合機制，抗體可以「標記」外來微生物以及受感染的細胞，以誘導其他免疫機制對其進行攻擊，又或直接中和其目標，例如通過與入侵和生存至關重要的部分相結合而阻斷微生物的感染能力等，就像通緝犯上了手銬和腳鐐一樣。針對不同的抗原，抗體的結合可能阻斷致病的生化過程，或者召喚巨噬細胞消滅外來物質。而抗體能夠與免疫系統的其它部分交互的能力，是通過其Fc區底部所保留的一個糖基化座實現的。體液免疫
擬答
【命中特區】志聖生物技術學A01, p205-206, p106-112
  1. RNA-seq
    核糖核酸測序，簡稱RNA測序（RNA Sequencing, RNA-Seq），也被稱為全轉錄物組散彈槍法測序 Whole Transcriptome Shotgun Sequencing，簡稱WTSS）是基於第二代測序技術的轉錄組學研究方法。RNA測序是使用第二代測序的能力，在給定時刻從一個基因組中，揭示RNA的存在和數量的一個快照的技術。
    首先提取生物樣品的全部轉錄的RNA，然後反轉錄為cDNA後，進行的二代高通量測序，在此基礎上進行片段的重疊組裝，從而可得到一個個的轉錄本。
    RNA-seq即轉錄體測序技術，就是把mRNA、small RNA或非編碼 RNA等，利用高通量定序技術把它們的序列定出來，測知RNA含量。RNA-seq又稱全轉錄體散彈定序 (WTSS, Whole Transcriptome Shotgun Sequencing)，被視為轉錄體學上革命性的研究工具，是利用高通量定序法 (high-throughput sequencing) 將RNAs反轉錄的cDNAs定序的技術，用於研究細胞內所有RNA研究的新工具。
    RNA-seq定序的第一個步驟是分離純化RNA。
    以mRNA為例，因為它們的3’-端有poly (A)，因此利用oligo d(T)樹酯抓所有mRNA，隨即將mRNA以特定RNA水解酶逢機剪切，選定特定大小的片段 (~200 bases)，加入random primer反轉錄為cDNA，cDNA合成ds cDNA後接合adaptorDNA序列，進行cDNA 定序 (約25 bases即可)，所有cDNA片段 (約有百萬組)組合，定出各種轉錄體RNA序列。
    製備RNA-seq shotgun基因庫的步驟如下：

    相較於傳統的晶片與Sanger法，轉錄體的定序不需要預先針對已知序列設計探針，即可對任意物種的整體轉錄活動進行檢測，提供更精確的數字化信號，更高的檢測通量以及更廣泛的檢測範圍，是目前深入研究轉錄體複雜性的強大工具。基因在各種組織或是不同的刺激之下，會經由 RNA選擇性剪接（RNA alternative splicing）產生不同的亞型（isoform），或是經由 RNA editing 機制造成基因序列有所改變。此時 RNA-seq 不僅可以偵測基因表現量且還精準的讀取每一個序列。
    RNA-seq應用領域：轉錄體結構研究 (包括基因exon/intron界限鑑定、可變剪切研究等)，轉錄體變異研究 (如基因融合、編碼區SNP研究)，非編碼區域功能研究(non-coding RNA研究、microRNA前驅體研究)，基因表達量的研究以及全新轉錄體的發現等。
  2. Ribo-seq
    核糖體圖譜(Ribo-seq)或稱Ribosome profiling或 ribosome footprinting，由Ingolia等人2009年Science上首次發表。從另一個角度研究翻譯，用低濃度的核糖核酸酶(RNase)處理細胞裂解物，使mRNA降解，但核糖體保護的RNA片段除外。然後，用下一代測序(NGS)分析22-35 nt的mRNA片段(即核糖體足跡，RFPs)，相當於核糖體保護片段(RPFS)，以揭示核糖體的位置和密度。因為mRNA表現量並無法很好的解釋蛋白質表現量的差異，美國的Nick Ingolia和Jonathan Weissman便在RNA-seq的基礎上發展出了Ribo-seq，差別是後者在處理樣本的過程中，加入了ribonuclease，將沒有核醣體保護的RNA分解，只分析有核醣體結合、當下正在進行轉譯的RNA片段（ribosome-protected RNA fragments, RPFs），能讓大家進一步了解轉譯調控（translational regulation）的作用。
  3. 全基因體定序(whole genome sequencing, WGS)全基因組定序（Whole genome sequencing, WGS）為對單一生物體基因組做完整DNA序列的過程，其中包含了生物體的染色體DNA、粒線體DNA及植物葉綠體DNA等，目前全基因組定序被廣泛地用作研究工具，並且在未來也會應用在個人化醫療作為診斷的依據。
    基因定序為研究基因的最初始關鍵，而根據定序的目標包含：全基因、外顯子及特定目標基因，又可細分成Whole genome sequencing、Whole Exome Sequencing、Targeted Sequencing。
    全基因體定序是針對特定模式物種的完整基因體定序。目前已完成全基因體定序的物種包括人類以及數種模式動物。許多影響人類健康和生活的物種，比如細菌和真菌也有許多全基因體定序的案例。此項研究適用於特定物種基因體的深度分析，例如人類疾病相關的基因研究。
擬答
【命中特區】志聖生物技術學1W, p141-164
  1. 檢測SARS-CoV-2感染之受檢檢體
    1. 以無菌病毒拭子之棉棒擦拭咽喉或鼻咽，插入病毒保存輸送管。
    2. 以鼻咽檢體，準確度較高。
  2. 檢測SARS-CoV-2方法
    實驗室診斷方法與原理
    1. 在P2 &P3實驗室培養分離SARS-CoV-2病毒
      實驗室分為P1到P4四種不同安全等級，「P」 為"Physical containment level"（物理收容等級）之意，其中P1實驗室適用於處理對個人及社區具低度危害性之微生物；P2實驗室適用於處理對個人具有中度危害性，而對社區之危害有限之微生物；P3實驗室適用於對個人具有高度危害性，而對社區具有中度危害性之微生物；P4實驗室則適用於處理對個人及社區同樣具有高度危害性之微生物。SARS或這次COVID-19的研究，一般操作在P2實驗室，但病毒培養及分離純化則需要在P3實驗室裡操作。
      SARS-CoV 2病毒培養依據疾病管制署公告「醫學實驗室處理嚴重特殊傳染性肺炎檢體之實驗室生物安全指引」指出，有關進行涉及病原體在體外或體內增殖之診斷試驗，須於 BSL-3 (P3)實驗室下進行，以提高生物安全防護。因此國內實驗室需具備生物安全第三等級實驗室才有資格進行SARS-CoV 2的病毒培養，有鑑於病毒的分離對於研發有效疫苗、抗病毒藥物篩選及發展快速而精準的檢測試劑非常重要且必需。因此許多國家在疫情發生時，均成功分離出病毒株，包含臺灣。
    2. Nucleic acid hybridization
      利用具特殊專一性之探針 (probe)，結合上放射性32P或者螢光染料，將檢體中的病毒核酸RNA，以篩選檢體是否含有病
    3. Real time RT-PCR
      萃取病毒RNA，利用反轉錄酶及dNTPs將RNA反轉錄為cDNA，再利用具特殊專一性之引子（primers），將檢體中的病毒核酸 DNA/RNA 經由螢光(CYBR Green)定量聚合酶連鎖反應 (real-time PCR)或一步法反轉錄螢光定量聚合酶連鎖反應(One-step RT real-time PCR)，增幅出 DNA 片段，以篩選檢體是否含有病毒。所用之引子是根據病毒序列設計。此法需搭配螢光定量聚合酶連鎖反應儀器，平均耗時 2-4 小
    4. Enzyme-linked Immunosorbant Assay (ELISA)
      酶聯免疫吸附試驗的常見做法為，將特異性抗體（一抗）覆蓋到96孔盤中，藉以捕捉檢體中相對應的抗原，然後加入第二個特異性抗體，目標抗原會被夾在兩個特異性抗體中間，接著再使用酶標記二抗與受質反應，反應後的顏色深淺程度直接反映檢體的病毒量，對難以分離培養、形態特殊或病毒量較多的檢體，ELISA檢測可以提供快速有效的病毒鑑定方法。
      Sandwich ELISA
    5. 快速試紙檢測法
      新冠病毒快篩試劑內含的試紙可依序分成4個部件：檢體層、膠體金抗體層、硝化纖維膜與吸收層。當含有受檢者呼吸道分泌物的檢體加到檢體層時，因各層纖維中的毛細作用將檢體內液體分子帶向最後方吸收層。檢體中含有新冠病毒蛋白抗原流經膠體金抗體層時，可以識別新冠病毒抗原的單株抗體會認出而與其結合在一起，而此處的單株抗體是已經結合了奈米等級膠體金的特製化抗體，也是快篩試劑能夠形成暗紅線條的原因。接著，抗原-膠體金抗體結合物流經有二道線的硝化纖維膜，第一道是測試線，含有能抓住新冠病毒蛋白抗原的抗體，而第二道線則是控制線，有能抓住膠體金抗體分子的抗體。當受檢者體內有新冠病毒時，經硝化纖維膜則會呈現雙線，代表陽性結果。反之，受檢者體內沒有新冠病毒時，只呈現單線結果，代表陰性。
    6. 電子顯微鏡與冷凍電鏡法
      1. 冷凍電鏡法 (一般貴重實驗室可以執行)
        用於病毒型態和結構的觀察，可將病毒懸浮液經過高濃縮和純化後，以磷鎢酸負染與電子顯微鏡直接觀察病毒之大小、形態，可初步判斷此病毒屬於哪一科。此作法繁瑣，臨床上多已被免疫或分子生物的檢測方法所取代。
      2. 冷凍電鏡法 (只有少數實驗室可進行，如中央研究院)
        把生物檢體溶液滴在銅網上， 並且把多餘的樣品移除。通過零下-196oC液態乙烷，高速投入銅網後，會在生物分子周遭溶液形成玻化水，並且在觀測樣本期間都維持低溫，當溫度高於攝氏 135 度則玻化水會形成冰晶。透過網眼間的薄區玻化水觀測生物分子。
擬答
  1. 蛋白質A預估分子量
    1.5 kb cDNA如果全部表達蛋白質，則1500/3 = 500胺基酸，一胺基酸平均分子量為110 daltons，因此，蛋白質A預估分子量為110 x 500 = 55 kDa。
  2. 55 kDa外加二條bands: +2 kDa (~57 kDa)及-7 kDa (~48 kDa)原因:
    因為1.5 kb cDNA來自於mRNA反轉錄，不含起動子。此1.5 kb cDNA是插入表現載體，基因工程剪接後在酵母菌內表達，起動子—核醣體結合部位—ATG—1.5kb cDNA—TAA等。酵母菌會進行轉譯後修飾，因此比55 kDa較大的區域會有band。表現載體也有可能有IRS (內側核醣體進入部位)，或者經過蛋白質裁減(protein splicing)，所以比55 kDa較小的區域會有另外一條band。
擬答
【命中特區】志聖生物技術學A01, p293-298
  1. 選殖蛋白質A完整模板基因序列 (template DNA)
    完整模板基因序列: Promoter –Ribosome binding site (RBS)—ATG—Protein A Gene –TAA stop codon。本題是將蛋白質A完整模板基因序列插入表現載體pEX-C-His vector 的多重限制酶選殖區域MCS內，此載體已經具備Promoter –Ribosome binding site (RBS)，及後端的stop codon，因此基因本身Promoter –Ribosome binding site (RBS)可以省略。
  2. 選殖的模板基因剪接插入載體的區段：
    1. 插入載體pEX-C-His vector多重限制酶選殖區域(MCS, multiple cloning site)中。
    2. 成功表現大量蛋白質A需要考慮因素:
      1. 強力DNA複製起始區，能夠大量複製蛋白質A。
      2. 有LacI區域，需要加入乳糖抑制LacI repressor誘導基因表達。
      3. 加入ampicilin篩選抗藥質體表達。
      4. 強力T7起動子及RBS，使後端序列包括蛋白質A基因轉錄與轉譯。
  3. 最簡便有效的分離純化方法:
    由於基因重組技術的進步，越來越多研究者試圖將特定基因選殖至表現載體，並大量表現重組 蛋白；但是不論以何種宿主細胞內除了重組蛋白質以外，仍有上千種以上細胞使用的蛋白質，因此 在收集粗蛋白後的首要工作，就是面對將重組蛋白由粗蛋白中純化出來的問題。一般純化蛋白值的 方式包括了鹽溶鹽析、膠體過濾、離子交換、親和層析等方法，而親和層析法正是廣泛應用於一般 實驗室甚至工業級純化常用的的蛋白質純化方法。
    最好選擇蛋白質A-Tag技術，表達蛋白質後以親合性管柱層析法分離純化。
    在蛋白質A基因後端接上(CAC)6，表達出蛋白質A—(His)6，稱為蛋白質A-(His)6 Tag技術，進一步利用Resin-Ni affinity column去分離純化。
    Histidine-Tag純化原理與流程:
    Polyhistidine (His)-Tag 純化是屬於金屬親和層析法 (immobilized metal-ion affinity chromatography，IMAC)的一種，主要是利用蛋白質的組織胺酸（histidine）的氮原子作為路易士鹼（Lewis base），與金屬離子作為具有空價軌域的路易士酸（Lewis acid）形成配位鍵結。當 His-Tag融合蛋白質通過 Ni-resin，鎳離子空出的配位鍵與 His-Tag 結合使融合蛋白質留在 resin上；經過淋洗步驟後，再以高濃度的 imidazole與 His-Tag 競爭配位鍵並使融合蛋白質(本題指蛋白質A)脫離完成蛋白質純化。
  4. 利用大腸桿菌表達製造的蛋白質A喪失功能原因:
    1. 由題意知，載體pEX-C-His vector中插入的蛋白質A基因在大腸桿菌內可以表現，因此，起動子與核糖體結合仍有作用。
    2. 蛋白質A基因在大腸桿菌內可以表現後，可能沒有作出正確摺疊，因此沒有功能。
    3. 蛋白質A可能是糖蛋白質，在大腸桿菌內可以表現後，沒有糖基化，因此沒有功能。
    4. 蛋白質A基因在大腸桿菌內可以表現後，可能沒有作出正確修飾作用，因此沒有功能。
    5. 蛋白質A基因在大腸桿菌內可以表現後，形成inclusion body，無法分離純化，因此沒有功能

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